Kutatásunk során elsődleges szempont volt az, hogy genetikai mutációk vizsgálatát számítógép és internetkapcsolat segítségével, ingyenesen elérhető szoftverek alkalmazásával megtervezzük, majd ezeket a gyakorlatban teszteljük. Modellnek a kinurenin-3-monooxigenáz (KMO) gén mutációit választottuk, melyek vizsgálatához többféle, polimeráz reakción (PCR) alapuló módszert is terveztünk.

A Triptofán lebontása során keletkezik a 3-hydroxi-kynurenin (3-HK) a központi idegrendszerben, ennek a metabolikus lépésnek a kulcsenzime a KMO. A 3-HK szabadgyök-képző, és fokozza az oxidatív stresszt, mellyel neuronális károsodást okoz. Emiatt feltételezhetően szerepe lehet neurológiai kórképek kialakulásában.

A KMO gén nyolc egyedi nukleotid polimorfizmusát (single nucleotid polymorphisms, SNP) idáig skizofréniában szenvedő betegek körében vizsgálták. Célunk egy olyan módszer kidolgozása és optimalizálása volt, mellyel egyszerűen, gyorsan és költséghatékonyan analizálhatóak a KMO gén polimorfizmusai. Az általunk beállított módszerrel más, neurodegeneratív betegségekben (pl. sclerosis multiplex, SM) szeretnénk vizsgálni ezen SNP-k jelentőségét.

A restrikciós enzimek és a primerek tervezésekor olyan programokat használtunk, melyek bárki számára ingyenesen elérhetőek az interneten, mint például az NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)-, REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html) – és az IDT (http://eu.idtdna.com/site) honlap. Annyira rövid amplikonokat terveztünk, hogy alkalmas legyen mind az RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfizmus), mind a HRM (nagy felbontású olvadáspont analízis) elvégzésére. A HRM analízis a legújabb technika a SNP-k detektálásában. A vizsgálat az amplifikáció után történik úgy, hogy a hőmérséklet emelésével meghatározzuk a 2 szálú DNS olvadáspontját. Ennek kivitelezése valós idejű PCR segítségével történik. A mintához fluorescens festéket adunk, mely interkalálódik a DNS-hez és fluorometriásan mérhető. Az olvadáspont analízisnél a hőmérséklet felbontás 0,1 ^oC pontosságú. A mutáns fragmentek olvadáspontja más, mint a vad típusé. A különböző allélok az ovadáspont görbén jól elkülöníthetők. Előnye az RFLP-vel szemben, hogy számítógépes program segítségével az olvadáspont görbék egyszerűen és gyorsan értékelhetőek, így nincs szükség gélelektroforézisre, és lehetővé válik nagyszámú beteganyag vizsgálata rövidebb idő alatt.

A KMO gén RS_2275163 számú mutációját mind RFLP, mind HRM technikával sikeresen teszteltük, ezzel bebizonyítottuk, hogy az „in silico” megtervezett kísérlet a gyakorlatban kivitelezhető.